TECNICHE BIOCHIMICHE E BIOMOLECOLARI CON LABORATORIO
Anno accademico 2021/2022 - 2° anno - Curriculum Chimica BiomolecolareCrediti: 6
SSD: BIO/12 - BIOCHIMICA CLINICA E BIOLOGIA MOLECOLARE CLINICA
Organizzazione didattica: 150 ore d'impegno totale, 93 di studio individuale, 21 di lezione frontale, 12 di esercitazione, 24 di laboratorio
Semestre: 1°
Obiettivi formativi
Lo studente acquisirà competenze relative alle tecniche per l'analisi degli aspetti biochimici delle cellule dei procarioti ed eucarioti e delle tecniche di colture cellulari, anche su larga scala; per lo studio della struttura, funzioni ed analisi delle macromolecole biologiche e dei processi cellulari nelle quali esse intervengono.
Modalità di svolgimento dell'insegnamento
Lezioni frontali ed esercitazioni pratiche in laboratorio. Qualora l'insegnamento venisse impartito in modalità mista o a distanza potranno essere introdotte le necessarie variazioni rispetto a quanto dichiarato in precedenza, al fine di rispettare il programma previsto e riportato nel syllabus.
Prerequisiti richiesti
Conoscenze acquisite durante i corsi di laurea triennale in chimica, in biologia e in biotecnologie
Frequenza lezioni
Le lezioni si svolgono durante il secondo anno, primo semestre, sei-otto ore la settimana.
Contenuti del corso
Colture cellulari: colture cellulari primarie e linee cellulari. Terreni di coltura
Saggi per l’analisi del ciclo cellulare, proliferazione cellulare, vitalità e morte cellulare.
Reazione di polimerizzazione a catena (PCR), sintesi di cDNA tramite Trascrizione inversa. Parametri e programmi bioinformatici per la progettazione di primers per PCR (primer 3 NCBI).
Analisi qualitativa e quantitativa di trascritti.
Valutazione di polimorfismi tramite PCR quantitativa o “real-time PCR”
Reazione di digestione con enzimi di restrizione. Reazioni con enzimi di modificazione.
Estrazione e dosaggio spettrofotometrico di acidi nucleici e proteine.
Elettroforesi di acidi nucleici e di proteine.
Tecniche di ibridazione. Preparazione di filtri tramite la tecnica del Southern blot, del Northern blot e del Western blot.
Preparazione di campioni di DNA o di RNA per l’analisi globale del genoma e dell’espressione mediante microarrays.
Tecniche di Sequenziamento degli acidi nucleici di I, II e III generazione
Analisi delle modificazioni epigenetiche (metilazione)
Tecniche di trasfezione transitoria e stabile e di soppressione dell’espressione genica mediante “RNA interference”
La tecnologia del DNA ricombinante e il clonaggio: preparazione di un vettore plasmidico ricombinante; trasformazione batterica ed estrazione di DNA plasmidico
Valutazione di attività enzimatica in campioni biologici.
Banche dati.
Le tecniche di laboratorio biochimico e biomolecolare nella diagnostica molecolare medica.
Esperienze di laboratorio
Esp 1 Colture Cellulari appartenenti a linee continue umane
Esp 2 Dosaggio di acidi nucleici
Esp 3 Estrazione DNA e/o RNA da colture cellulari continue
Esp 4 Elettroforesi in gel d’agarosio
Esp 5 Sintesi cDNA
Esp 6 Reazione a catena delle polimerasi (PCR)
Esp 7 Digestione con enzimi di restrizione
Exp 8 PCR quantitativa/qRT Discriminazione Allelica
Esp 9 Trasfezioni e Silenziamento
Testi di riferimento
1) Metodologie Biochimiche e Biomolecolari, a cura di Maccarone M. e colleghi, Zanichelli editore
2) Biologia molecolare, F.Amaldi, et al. Casa Editrice Ambrosiana – Zanichelli.
3) Metodologie biochimiche. Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine, M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, et al. CEA.
4) Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso,
5) Video-corso online di “Biotecnologie Diagnostiche” composto da 3 lezioni ed una esercitazione di laboratorio prodotto all’interno di un progetto didattico europeo (D.F. Condorelli, V. Barresi) http://www.dsf.unict.it/index.php?page=progetto-phar-in, Video-corso online "Riparazione del Dna e mutagenesi nel cancro" (D.F. Condorelli): Mismatch repair (MMR) instabilità dei microsatelliti (V. Barresi), Video-lezioneTecnologie avanzate per la Bio-Medicina Genomica (Vincenza Barresi),.
Programmazione del corso
| Argomenti | Riferimenti testi | |
|---|---|---|
| 1 | Colture cellulari: colture cellulari primarie e linee cellulari. Terreni di coltura | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 2 | Saggi per l’analisi del ciclo cellulare, proliferazione cellulare, vitalità e morte cellulare. | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 3 | Reazione di polimerizzazione a catena (PCR), sintesi di cDNA tramite Trascrizione inversa. | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 13 |
| 4 | Parametri e programmi bioinformatici per la progettazione di primers per PCR (primer 3 NCBI). Analisi qualitativa e quantitativa di trascritti. | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 13 Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 5 | Estrazione e dosaggio spettrofotometrico di acidi nucleici. | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 11-12 Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 6 | Estrazione e dosaggio spettrofotometrico di proteine. | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 7 | Elettroforesi di acidi nucleici . | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso, Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA |
| 8 | Tecniche di ibridazione. Preparazione di filtri tramite la tecnica del Southern blot, del Northern blot e del Western blot. | 1)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA |
| 9 | Preparazione di campioni di DNA o di RNA per l’analisi globale del genoma e dell’espressione mediante microarrays. | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 11,12 13, 29 Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 10 | Tecniche di Sequenziamento degli acidi nucleici di I, II e III generazione | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 8, 13, 29 Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 11 | Analisi delle modificazioni epigenetiche (metilazione) | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 17 Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 12 | Tecniche di trasfezione transitoria e stabile, Silenziamento ed overespressione genica | 1) Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 16, 18 2)Fondamenti di biologia molecolare, L.A. Allison Zanichelli. 2)Biologia molecolare, F.Amaldi et al. CEA – Zanichelli. 3) Metodologie biochimiche...M. L. Di Salvo, et al. CEA |
| 13 | Vettori di espressione genica e tecnologia CRISPR/Cas9 | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 19 |
| 14 | Valutazione di attività enzimatica in campioni biologici, tecniche spettroscopiche e analisi al citofluorimetro | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 6, 25, 26 |
| 15 | Banche dati. | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 20 |
| 16 | Le tecniche di laboratorio biochimico e biomolecolare nella diagnostica molecolare medica. | Metodologie biochimiche e biomolecolari, a cura di Maccarrone, cap. 30 |
| 17 | Esperienze di laboratorio Esp 1 Colture Cellulari appartenenti a linee continue umane | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 18 | Esperienze di laboratorio Esp 2 Dosaggio di acidi nucleici | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 19 | Esperienze di laboratorio Esp 3 Elettroforesi in gel d’agarosio | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 20 | Esperienza di laboratorio Esp 4 Reazione a catena delle polimerasi (PCR) | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 21 | Esperienza di laboratorio Esp 5 Progettazione primers per amplificazione PCR | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 22 | Esperienza di laboratorio Esp 6 Analisi di sequenze di acidi nucleici in banche dati | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
| 23 | Esperienza di laboratorio Esp 7 Trasfezioni e Silenziamento | Lavori scientifici e materiale didattico fornito dalla docente del corso |
Verifica dell'apprendimento
Modalità di verifica dell'apprendimento
Verifica con Esame Orale. La verifica dell’apprendimento potrà essere effettuata anche per via telematica, qualora le condizioni lo dovessero richiedere.
Esempi di domande e/o esercizi frequenti
Condizioni per mantenere linee continue di colture cellulari eucariotiche (Conoscenze teoriche e pratiche per essere effettuata in laboratorio)
Saggi di vitalità cellulare (Conoscenze teoriche e pratiche per essere effettuata in laboratorio)
Reazione a catena delle polimerasi (condizioni per effettuare una reazione in laboratorio)
Procedure per sequenziare frammenti di acidi nucleici
Procedure per valutare quantitativamente frammenti di acidi nucleici
Dosaggio spettrofotometrico di acidi nucleici e proteine
Tecnologie basate sull'ibridazione di acidi nucleici
Metilazione del DNA e valutazione dello stato di metilazione
Silenziamento genico
Progettazione di oligonucleotidi (primers) per l'amplificazione di frammenti di acidi nucleici